stLFRの進捗を共有しましょう。

・これまでの実験結果整理
Trial 1: 林くん
プロトコール通りInput DNA 10 ngで行った。トランスポゾンを混ぜるところまでは1回、そこから先のビーズを加えてライゲーション・PCRするところは2回試したが、最終的に得られたPCR産物の濃度が低く、また長さが短かった。2回目の実験の際には、最後のPCRのサイクル数を既定の9サイクル回してテープステーションで確認した後、さらに9サイクル回したサンプルもテープステーションで確認した。
（ @林健太朗 参考となるテープステーションの図を添付して貰えると助かります。）

Trial 2: 平西くん
プロトコールの10倍量Input DNAを使うように私が依頼しており、100 ngでスタートした。結果は今日出る予定？

stLFRの概略図を見直すと、断片化されるのは、ビーズにくっついたあとというか、PCRして初めて断片化される仕組みですかね。
https://decodescience.com.au/single-tube-long-fragment-reads-st-lfr/

なので、最初のトランスポゾンを加えた後にテープステーションで見て断片化されていないのは正しいと言えそうです。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6499310/
の論文の中でstLFRの原理が書かれています。ここで使用しているトランスポゾンはニックを入れている状態で止まっているらしく、二本鎖切断は生じない状態で、ニックの箇所にアダプターをライゲーションしてY字型の構造を作らせるみたいです。

DNAにニックが入った状態というのは、テープステーションではなく、変性ゲルを使えば検出可能ではありますが、放射線使わないと検出感度悪いんじゃないかなとか思ってしまうので、やはり最後のPCRで増えるかどうかを確認するのが無難そうです。

今PCRしています。
昨日のアドバイス受けて9サイクルではなく20サイクルでやっています。
終わり次第テープステーションやって共有します。

論文きちんと読めてないんですが、マニュアルの流れの
transposon insertion →capture
→ligation reaction 1
→digestion reaction 1
までのステップで順次切断しているということなんですかね？
マニュアルではdigestion reaction 1までのステップではDNAの断片化を防ぐためにvortexが禁止されていて、
この後のtermination reactionから断片化完了しているのでvortexやっていいと書いてました。
断片化できてるか調べるのならtermination reactionが終わったサンプルをテープステーションにかければいいのでしょうか？

おそらく、transposon insertionでDNA二本鎖の片方に切れ目が入ります。
そして、ligation reaction 1で切れ目のある片側の鎖だけアダプターがライゲーションされて、二本鎖ではなくY字型の構造になります。
https://decodescience.com.au/single-tube-long-fragment-reads-st-lfr/
の図の真ん中下のLigate with barcoded oligoがこのステップだと思われます。
digestion reaction 1はトランスポゾンを除去しているのでしょう。

その後のLigation Reaction 2が、おそらく上の図の右下にある「Ligate 2nd adapter」になるのかなと思います。
なので、3.8 PCRまで行って初めて断片化されるのだろうと思います。

それまでは切れ目が入ったDNAなので、1本鎖にして電気泳動が出来れば、切れ目があることがわかるのですが、おそらくテープステーションでは無理なのではないかな？と思います。

ありがとうございます

今、テープステーション終わったのですが、何も増えていませんでした。
本当に何もないのでハンドリングの問題かもしれないです。
もう一度マニュアル読んで来週チャレンジしようと思います。

電気泳動してみるのもありかもね

HS D1000だと1500までしか見えないから

自分のサンプルの結果です。C1がトランスポゾンインサーション時点でのサンプルで、D1がPCR後の同サンプルです。

電気泳動してみます、ありがとうございます！

stLFRの実験プロセスについて、関係者で精査したいと思います。
この数カ月以内でゲノム解析が必要なメンバーには参加をもとめます。

高分子DNA抽出キットが楊くんの分で無くなりそうなので1つ発注させて頂きます。

NucleoBond HMW DNAキットでヒラミルミドリガイのDNAを抽出しました。Qubit(BR)で測定した濃度は4.16ng/μlで、テープステーションではピークが60kbpより長いところにでました。
長いのが取れたのでこの後プロトコル通りすすめてみます。

ゲノムシーケンシング関係者
7・28～３０にstLFRの実験プロセスのチェックを関係者で行いたいと思いますが、都合いかがですか？

Zoomであればいつでも大丈夫です。29日は大学に行く予定です。

stLFRは、シーケンスが読めさえすれば研究室のサーバを使ってヒトゲノムのアセンブルでも2日で終わってました。
N50は200 kbp程度で1 Mbpには届いていませんが、もし読めるならナノポアよりも1/5以下の安価で読めて、インプットのDNAも少なく済んで良さそうです。

あとは、どうやって読めるようになるかですね。。。
最近GeneBayのHPが更新されて、stLFRのライブラリ調整から受け付けてくれるようになっていました。とりあえず価格を聞いておこうと思います。

明日はラベブさんの実験を手伝うかもしれないので水曜日、木曜日のが良いかもしれません。

有難うございます。では29日の午後にしましょう

先ほどGeneBayさんに聞いたら、必要なDNA量100ng、ライブラリ調整からで25万円、納期3～4か月だとのことでした。
ナノポアと違ってブレが少なく安定しているとのことでした。
stLFRを外注で25万円と比較すると、ナノポアはMinIONで30x程度読もうとすると、ゲノムサイズに依存してお金がかかるのと、ヒラムシの場合、合計ナノポア50万円（もっと？？）＋Illumina15万円かかっているので、ＤＮＡ発送で25万円でシーケンスデータが出るなら安いものかなと思いました。
自前でライブラリを準備出来れば、おそらくstLFRのキット代1サンプル1万円＋シーケンス12万円程度になります。

納期が長いのは、DNBSEQシーケンサーの4レーンが埋まってからでないとシーケンス出来ないからだそうで、4サンプル頼むならすぐだと言ってました。

急ぎのサンプル４つをすぐ発注しましょう。

1レーンの中でマルチはできますか？

恐らくできると思われます。

ただ、ライブラリ調整費用が1サンプル5～10万円は別途かかると思います。

それでも大丈夫だと思います。とりあえずサンプルリストをつくりましょう。

承知しました！！

ジーンベイからのメールを転送します。
==========================
吉武　先生

お世話になっております。
お問い合わせありがとうございます。

stLFRライブラリー調製およびMGISEQによるシーケンシング1レーン（2x100bp + UMI:42bp)のお値段とサンプル要件は以下のようになります。

a) サイズセレクション済み DNAをご提供いただく場合 237,000円（税別）
DNA量：100ng以上
DNA濃度：2ng/ul以上
260/280: 1.6 - 2.2
260/230: 2.0以上推奨
DNA断片長：40kb以上
DNAの分解、RNAやタンパク質などのコンタミネーションがないこと
TE溶液で提出

b) サイズセレクションしていないDNAをご提供いただく場合 272,000円（税別）　※弊社にてサイズセレクションを実施
DNA量：4ug以上（DNAの分解度合いによる）
DNA濃度：70ng/ul以上
260/280: 1.6 - 2.2
260/230: 2.0以上推奨
RNAやタンパク質などのコンタミネーションがないこと
TE溶液で提出

なお、1レーンで得られるサンプルの配列は60~90Gbほどになります。
以上どうぞよろしくお願い申し上げます。
＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／
株式会社ジーンベイ（GeneBay, Inc.）
代表取締役社長
上村　泰央　／　UEMURA YASUO
〒222-0033
神奈川県横浜市港北区新横浜3-8-8 日総第16ビル401
TEL: 045-534-7647　Mobile: 070-6642-0046
FAX: 045-534-7648
Email: uemura@genebay.co.jp
URL: http://www.genebay.co.jp
＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／

@村茉南 @平西滉太 外注を検討するとしても、私たち自身でライブラリ調整を行えるようになっておきたいので、stLFRのライブラリ調整について、引き続き検証をお願いします。

stLFRのライブラリ調整も外注でシーケンスしたい人は下記のシートにサンプルを記入しておいてください。
https://docs.google.com/spreadsheets/d/1rW7QIkSOcffnDncsR98n1GlOTLyqy3oS8ptJQHMZUzo/edit?usp=sharing

すみません、内定者勉強会のため遅れています

The composition of Buffer EB is:
10 mM Tris-Cl, pH 8.5
とのことなので、Buffer EBでも良いのではないでしょうか。

TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)
のようなので、pHが少し違うというのはありますが。心配なら聞いてみましょうか？

SRE XS & LowBind 1.5 ml tubes have been stored  the Yonezawa's drawer.
There are Yonezawa's drawer near the microscopie.

先生，I had tried 3times of kudoa gDNA extraction, but failed. 2 times to use nucleobond hmw DNA, concentration(ki004, kh001) is lower than 0.5ng/ml by qubit(hs); 1time to use blood &tissue midi kit, concentration(kse001) is only 0.126ng/ul.

I think it would be better to experiment with positive control. If anyone has any extra samples of zebrafish or cultured cells or anything else, please provide it to Yang san.

I see, thank you sensei.

@楊晨曦 If you can't extract DNA from positive control then will try again with me.

Yan and yoshitake-san
We choose 3 better samlpes from 6samples. It was hard to get even normal DNA (not HMW). That mainly depends on samples themselves.
It may be better to retry, so Yang, once try to use the kit with control samples  as Yoshitake suggest. Then check your procedure (or kit) are good or bad, today or tomorrow (that means do it soon).

We can not get additional samples easily, and the samples are not remaining sufficiently.
So go ahead using available DNA even if they are not HMW. Off course you get better samples uses them.

Thank you sensei and yonezawa san. I will retry from positive control tomorrow.

今なら納期20日くらいでstLFRを読んでくれるようなのですが、DNAをすぐ発送できる人はどのくらいいますか？
Now it looks like GeneBay can read the stLFR with a delivery time of 20 days, but how many people can ship the DNA right away?

少なくとも下記の条件を満たす必要があります。最低限DNA量、濃度、OD 260/280の条件は満たしてください。
At least the following conditions must be met. At least, DNA volume, concentration and OD 260/280 should be met.

DNA volume：more than 100ng
DNA concentration：more than 2 ng/ul
OD 260/280: 1.6 - 2.2
OD 260/230: 2.0 or higher recommended
DNA fragment length：over 40kb

短いDNA断片がある人は、ショートリードエリミネーターを使ってから、十分量のDNAが残るか確認してください。
If you have short DNA fragments, use a short read eliminator and then make sure you have enough DNA left over.

stLFRの外注を希望する人は、下記のシートにDNA濃度などを書き込んでください。
If you wish to outsource stLFR, please fill out the sheet below with your DNA concentration and other information.

https://docs.google.com/spreadsheets/d/1rW7QIkSOcffnDncsR98n1GlOTLyqy3oS8ptJQHMZUzo/edit#gid=0

OD 260/280は311にあるナノドロップで測定可能です。
OD 260/280 can be measured by nanodrops in 311.

すぐ発送できるかと思います。

以前測ったのが、半年以上前なので濃度等は再度測り直します。

すぐ発送できます

対応が遅れてすみません。本日抽出作業を行います。

すぐに発送できます

遅くなってすみません、すぐに発送できます。

@林健太朗 @村茉南 二人ともOD 260/230の値が低めですね。二人ともDNA抽出を同じキットで行って、そのままの値なのでしょうか？それともその後精製したりしていますか？

私のはそのままの状態です

そのままです

一応OD260/230>=2.0となっているので、エタ沈か何かで精製してみたほうが良いのかなと思いますが、試すだけのDNA量はありますか？

まぁフェノール使っているわけではないでしょうから、高くても問題ない可能性が高いと思いますが。

どのくらいのDNA量が必要ですか？

腕次第ではありますが、、、1 ugとかをエタ沈すればペレットが見えると思うので、まず失敗はしないかなと。

@Yonezawa Ryo こういう時、いつも使っているキットとかありますか？

おそらく1μgも無いのでちょっと怖いですね

nucleobondで抽出したもので試した訳ではないので、どれくらい断片化するかは分からないです。

エタ沈とSREは試していて、エタ沈は若干ピークが下がった記憶です。

不用意なことをやるとDNAを全部失います。楊くんのも村のも簡単には得られないDNAなので、あまりPurifyにこだわると、DNAそのものをロストすことを心配しなくてはいけません。
エタノール沈殿は適切にやると少量でも回収率はいいのですが、やるならエタ沈メイトを使ってください。内容はグリコーゲンだと思います。知られている範囲でその後の酵素反応などを阻害しないと言われてます。今回の場合がどうかはわかりません。先方にもDNA自体が貴重なので、カタログ通りの数値が出なくても構わないということを伝えておくのが良いと思います。必要であれば私から相手の担当者、技術者に話してみます。
If you do something careless, you will lose all of your DNA. Both Yang's and the village's DNA are not easy to obtain, so you have to worry about losing the DNA itself if you stick to Purify too much.
Ethanol precipitation has a good recovery rate in small amounts when done properly, but if you do it, use etha-precipitate-mate. I think the content is glycogen. It is said to not inhibit subsequent enzymatic reactions, etc. as far as is known. I don't know if that is the case in this case. I think it's a good idea to let the other party know that the DNA itself is valuable, and that it doesn't matter if it doesn't show the numbers as cataloged. If necessary, I will talk to the other party's representative and technician.

一応OD260/230 2.0以上推奨と書かれていましたが、そのままやってと言えばやってくれると思います。
ただ、余裕があるならばエタ沈かAMpureXPビーズあたりで精製しておくと、合成ロングリードの出来が良かったりするかもしれませんので、各自自分のDNA残量と相談してみてください。

@平西滉太 @Senevirathna Duminda Please fill the DNA concentration, etc. in the following sheet.
https://docs.google.com/spreadsheets/d/1rW7QIkSOcffnDncsR98n1GlOTLyqy3oS8ptJQHMZUzo/edit#gid=0

エタ沈で重要なのは
０　エタ沈メイトを加える
１　 pH5.5 or nearの　３M NaOAcを加えてよく混ぜる
２　2.5倍量のエタノールを加えて良く混ぜる　エタノールを吸うときは数回出し入れしてピペット内をエタノール蒸気で満たしてから。
３　−20Cで30分
４　~10,000rpmで5分。　上清はピペットで吸い取る。上清は捨てずに残しておく.エタ沈メイトを使えば沈殿は見えると思う。
５　70% EtOH を用時調整. 2と同じ注意。調整時、エタノール蒸気で満たす。
６　70% EtOHでリンス。上清はピペットで吸い取る。１、２度、スピンダウンし、最終的にはP10などをつかって完全に70% EtOHを除く。完全に吸い取れば乾かさなくてよい。乾かす場合でも10分程度

The key to ethanol precipitae is.
0 Add etha-precipitate-mate.
1 Add 3M NaOAc at pH 5.5 or near and mix well
2 Add 2.5 times the volume of ethanol and mix well. When you smoke the ethanol, take it in and out a few times and fill the inside of the pipette with ethanol vapor.
3 -20C for 30 minutes.
4 ~10,000 rpm for 5 minutes.　Aspirate the supernatant with a pipette. Do not discard the supernatant. If you use the etha-precipitate-mate, the precipitation will be visible.
Use 70% EtOH as a pre-conditioning agent. Use the same caution as in step 2. At the time of preparation, fill with ethanol vapor.
6 Rinse with 70% EtOH. Spin down once or twice, and finally remove 70% EtOH completely by using P10. If the supernatant is completely absorbed, it is not necessary to dry it. (About 10 minutes for drying).

高分子を扱う場合のエタ沈はinversion等で混和を行うのでしょうか？

とうまくん　そうでした。高分子でしたね。BACサイズはエタ沈しないほうがいいですが、ラムダサイズ５０kbくらいならエタ沈でもDNAはあまり壊れないでしょう。でもピペッピンング、ボルテックス、強いタッピングはしないほうがよいでしょう。DNAを吸うチップもライターの火で炙ったハサミを使って先を切ったほうがよいでしょう。
It was. It was a polymer....you shouldn't ethanol precipitate the BAC size DNA (100kb or more), but if it's a lambda size of 50kb or so, ethanol precipitatation won't break the DNA too much. But you shouldn't do pipetting, vortexing, or strong tapping, and the tip that sucks the DNA should also be cut off with a pair of scissors seared by a lighter.

遅くなりましたが、必要事項記入完了しました。

OD 260/230が5.14とは何か間違っていませんか？

先程ナノドロップで測ったのですが測り直した方がいいでしょうか

普通高くても2くらいなので、ちょっと変な感じがしました。 @Yonezawa Ryo ちょっと見てもらえませんか?

今測り直したのですが、OD260/230が2.22になりました。お騒がせしました。

吉武さん　小林さんも加えてください。

すみません、追加していると思ってました

Prepared the stLFR's box and stored 4°C (Black freezer) outside the 311.

please your samples have been prepared then stored this box.

GeneBayから返事がありまして、来週はお休みなので、17日に届くように発送してほしいそうです。
GeneBay responded to me and said they are closed next week, so they want us to send DNA samples to arrive at the 17th.

DNA濃度を何を使って測定したのかなどの情報も必要とのことなので、下記のシートに情報を記入してください。
They also need information on what you used to measure the DNA concentration, etc., so please fill out the information on the sheet below.

https://docs.google.com/spreadsheets/d/1rW7QIkSOcffnDncsR98n1GlOTLyqy3oS8ptJQHMZUzo/edit#gid=0

サンプルは1.5ｍｌチューブ（LoBind Tube)に保存し、チューブをパラフィルムで巻いてください。
私に直接渡すか、stLFR BOXに入れてください。BOXに入れた場合は報告してください。

Store the sample in a 1.5 ml tube (LoBind Tube) and wrap the tube in Parafilm.
Give it to me directly or put it in the stLFR box, please inform me if you put it in the box.

thank you informing..I will store the sample in today evening

Pleese fill the sheet at first!
https://docs.google.com/spreadsheets/d/1rW7QIkSOcffnDncsR98n1GlOTLyqy3oS8ptJQHMZUzo/edit#gid=0

先生，I finished positive control of HMW DNA extraction by nucleobond hmw DNA kit, sample was ayu liver(about160mg), resuspension buffer HE is 150 ul. Qubit(hs) is 1.63ng/ul, peak length is bout 25kb. I think the result is not bad. I also read the protocol of Qiagen MagAttract HMW DNA kit(which is highly recommended by stLFR kit), input amount tissue sample is only up to 25mg and yield a high concentration. Maybe this kit suit to my sample.

go!

But we do not have this kit.

I see, thank you sensei.

@Senevirathna Duminda I think Isn't the your purification method SRE?
If you used SRE then eluted buffer is mistake that please change Buffer EB.

ohh thank you

I'll be sending out samples of stLFR tomorrow or the day after tomorrow.

If you are ready in time, please fill out the form and store your sample in the Box.

本日、先に準備できた6サンプルを発送致しました。

Gooｄ！

Thank you

@村茉南 @Senevirathna Duminda
ジーンベイより連絡がありました。
DG3とH.fesにつきまして、溶液量が少ないため、stLFRのライブラリー調製に必要なDNA量のギリギリになりそうです。
場合によっては追加のDNAをいただく必要が出てくるかもしれませんが、まだサンプルは残っていますか？

message from genebay.
For DG3 and H.fes, we are likely to be at the very edge of the amount of DNA needed to prepare the stLFR library due to the low volume of solution.
In some cases, we may need to get additional DNA, but do you still have some samples left?

yes I have more DNA.. I can provide

@平西滉太 @林健太朗
genebayからの連絡です。
電気泳動像を確認したところ、一部のサンプルで分解がみられるようです。特に1~3 (P.mul, P.pell, S.pac)あたりがそうかと思いますが、もし再提出を希望されるようでしたらお知らせいただければと思います。
上記のエクセルを確認し、再提出希望の場合は早めに連絡ください

再提出の場合は、SRE（XS)処理を行い、断片化しているDNAを除去するものです。

しない場合も連絡ください。

低分子が存在する場合
低分子DNA断片が含まれている割合が多いほど、UMIビーズとDNA分子の1対1キャプチャーができず、低分子DNAが同じビーズにキャプチャーされてしまうリスクが高くなります。そうなりますと、同じUMIを持つ異なる一分子DNA断片由来のリードが得られてしまうキメラの割合が増えてしまうことになりますので、ご注意ください。

とのことです

米澤くんが指摘してくれている3サンプルはまだDNA量に余裕があると思うので、SRE処理して再提出にしましょう。特に2番は再提出必須でしょう。

承知いたしました。

私のサンプルは１回ならSRE処理できるので明日再調整いたします。

2番目は自分のサンプルなのですが残りのDNAサンプルは25㎕前後でSRE処理できる濃度の2.5倍ほど薄いです。提出はあと一回できるかどうかなのですが再提出したほうが良いですか？。

そのまま読むのもダメだとは思いませんが、今の状態だと合成ロングリードを読んでもジーンベイからの返事にあるようにキメラばかりになって不正確なゲノムになる可能性が高そうに思います。一旦SRE精製して、例え30ngになってもそのままやってもらう方が良いのかなとも思うので、まずは精製してみませんか？

わかりました全量使って精製してみます。

@平西滉太 SREXSの推奨濃度が25-150ng/ulです。　なので、液量に余裕があればエタノール沈殿してからSRE処理をしてください。

@林健太朗 @平西滉太 明日、用事があるため、１９-20時ごろになるかと思いますが、SRE処理をするので一緒に行う場合はその時間に来てもらえればと思います。
明日と日曜以外は昼前から22-24時ごろまで在室していると思うので、分からなければ教えます。

遅くとも来週の初めには送りたいと考えているので私含め３名は早めに作業を行いましょう。

了解です

全然大丈夫です！

SREは全体的に薄い泳動像になるから判断が難しいですが、stLFRは小さいDNAが入っていると影響が大きそうなので、米澤くんのは精製後の方が良さそうですよね。林くんのは小さいDNAが本当に除けたのか、テープステーションの結果からは判断がつきませんが、同じように除けていると期待するなら精製後の方が良いかなと思います。合計のDNA量は100ng 以上あったのでしょうか？

Qubitでは7.5ng/ulで20ulあるので計算上はあります。

それならば精製後の方が良さそうに思いますが、何か気になることがありますか？

今ナノドロップで測ってみたのですがQubitに比べて明らかに低い値になっています

テープステーションの結果を換算するとDNA濃度はどのくらいなのでしょうか？　NanoDropの値でも30ngはあるので、ジーンベイに意見を聞いてみるのも良いかもしれませんが、まずは正しい濃度を知りたいです。

テープステーションだと2kbpあたりに1.3ng/ulと30kbpあたりに0.5ng/ulと出てます。

とりあえず提出してみて先方に意見を聞いてみたいです。

2kbpあたりにピークは見えませんが、どういう範囲を指定したのですか？

オレンジの範囲なのでおそらく断片化したDNAだと思います

うーん、米澤くんのも250bpあたりにピークが見えますが、それがサンプル由来のピークだとするなら、どれも送るべきではないように思ってしまいます。ただ、米澤くんのはジーンベイがやってくれた電気泳動だと分解したDNAはなかったので、テープステーション由来のアーティファクトなのかなと思っていますが、誰か何か知っていますか？　明日平西くんのサンプルでもテープステーションを測るなら、平西くんのでも見えるのか、またDNA量に余裕のある人のDNAをアガロースゲル電気泳動して短いバンドが見えるのか確認した方が良さそうです。林くんのは特に数百bpの短い断片がアガロースゲル電気泳動で見えていたので、その辺りはきちんと評価しておいた方が良いと思います。

比べると断片化したものは取り除けている印象ですが電気泳動していないので詳しくは分かりません。

取り除けていたとして今回のDNA量で大丈夫なのかわかりませんが...

NanoDrop Oneでも検出感度は2ng/ul以上のようなので、今回の林くんのサンプルは正しく測定できていない可能性が高いのかなと思いました。テープステーションを信じるならば、0.5ng/ul程度で、合計10ngほどでしょうか。stLFRのカタログ値は10ngでOKだったけど、どこまで可能なのか、10ngで試したことがあるのかジーンベイに聞いてみようと思います。それとは別に低分子DNAを除去できているのかは林くんの方で先ほど私がコメントしたことなどの検証をしてみてください。

分かりました。
明日他のサンプルでテープステーションをしてみます。

あと、アガロースゲル電気泳動も行ってみてください。ジーンベイではゲルの方で判断しているようなので。

ではそれも明日やってみようと思います。

@林健太朗
ジーンベイからの返事がメールで届いているかと思いますが、下記のように10ngあれば良いようです。ジーンベイが100ng必要と言っていたのはQCのためで、stLFRは10ngでジーンベイでもOKなんですね。

「10ngは一回のライブラリー調製に必要な量になりますので、濃度が1~3 ng/uLの範囲に収まっていれば、チャレンジすることはできると思います。
10ngを下回っていたりすると、得られるライブラリー量が足りなくなり、結果として得られるシーケンスデータが減ってくることが考えられます。」

さて、現在の濃度は正直なところ0.5 ng/ulだと思いますが、Qubitでは1 ng/ulなどと出ていたと思うので、とりあえずそっちの濃度を書いて20ul提出してみるのが良いかなと思いましたが、どうでしょう？

データと一緒に、向こうで使用しなかったDNAは送り返してもらえるのではないかなと思います。

Qubitではなく、ナノドロップだったか。。。

そうですね、SREしたものを送りたいと思います。

１　現時点でのそれぞれの進み具合を教えてください。
２　今結局、送付済みは何ですか？
３　Tapestationの他の泳動のパターンはありますか？アポトーシスすると140bpの倍数のバンドが見えるはずですが、DNAはあのように滞留しないと思います。低分子の盛り上がりはRNAの可能性はないですか？あるいは吉武さんのいうようにアーキファクとかもしれません。

@林健太朗 昨日のテープステーションのバッファーのみの結果をここに貼り付けてください。

再送組（林・米澤・平西）の進捗状況は、米澤・林、SRE処理終了、平西君が現在SRE処理しています。

@Yoshitake Kazutoshi 平西君のSRE後の泳動結果です

tapestationはラダー使い切ったみたいなので電気泳動で確認してもらいました

genebayで見えていた10kbp以下は消えてそうですね。

5kb以下ですね、間違えました。

ナノドロップの結果なのですが、
260/280が0.86
260/230が0.51
になりました。
濃度とDNA量は提出に問題はなさそうです。

濃度が薄いとODあまり信用できなくなるので、260/280などが低いのは許容範囲かなと思いますが、DNA濃度はいくらでした？

濃度はQubitで11.6ng/μlで30μl溶液があります。

ナノドロップでのDNA濃度はいくらと出ました？

ナノドロップだと20.7ng/μlです

林くんのときは結構ずれてましたが、このくらいは許容範囲かなという印象ではあります。送ってみても良いのではないでしょうか。

それからオプティカルマッピングという手法の最新装置Saphyrのお試しで1サンプルだけ試薬代の30万円でやってくれるという話があるのですが、その際には凍結した組織サンプルを送る必要があるそうで、平西くんのは量が十分だろうと聞きましたが、興味はありますか？

了解しました。SRE処理後のDNAを送ろうと思います。

組織は十分量あるので、できるならやってみたいです。冷凍で保存して1年経つのですが、今のサンプル状態でも実行可能なのでしょうか？

冷凍保存は何度でしょうか？受託先に聞いてみたいと思います。

−20度で保存しています。

再送分3サンプルを本日発送いたしました。

@林健太朗
サンプル返送代1万円とは…、文句を言いたくもなりますが、送り返してもらったほうが良いのでしょうか？

高いですよね…

自分は今のところ他の用途に使うつもりもありませんので、返送は無くても構いません

RNAならまだ使うかもしれませんが、DNAだと使わない可能性が高いですかね。これ以上やり直すにしてもHiCにしろ組織が必要でしょうから。

組織全量使ってるはずなので、もし論文化できた時に標本登録してくれってなった場合だけが困るかもしれませんね

あ、、、ふーむ。。。　やっぱり戻してもらいますか？

その標本はDNAだけで良いのですか？

この前資源の黒木先生に見せて頂いた、東大博物館の資料室にはホルマリン漬けの魚の標本がたくさん並んでいたので、標本が必要なのかなぁと思っていました。

私が投稿したミトコンドリアの論文の場合はDNAまたは組織の標本登録だったので、DNAだけでも大丈夫です。

それでは林くんがミトコンドリアジャーナルに投稿するかどうか次第ですかね。

@林健太朗 SRE処理する前のサンプル、テープステーションやるのに数ul残してと言ったけど、まだ残ってるんだっけ？

2-3μL残ってます

なら、大丈夫かもしれませんね。

念のため今日確認してみます

あ、今回はサービスしてくれるという連絡がありましたね。。。

ありがたいですね

サービスしてもらえるなら返送してもらう方が良さそうですね。

米澤くんが発端のチョウザメ、バドルフィッシュのゲノム解析を行います。

高分子DNA用のキットを教えてください。

海外の共同研究者からですが、E.Z.N.A. Tissue DNA Kit from Omega は大丈夫そうですか？
もし、低分子が混じっていても除けますよね？
あるいは推奨のキットがあれば知らせてください。

浅川

ヌクレオボンド
https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100009416

マグアトラクト
https://www.qiagen.com/jp/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/dna-purification/genomic-dna/magattract-hmw-dna-kit-48/#orderinginformation

@KINOSHITA Shigeharu
BionanoのSaphyrですが、下記のようなお返事がありました。

==================================
ミクセルの與那覇です。

ご依頼いただきました見積書を添付いたします。(=>税込み35万円）
サンプルにつきましてですが、やはり正直お勧めはできないとのことです。
基本、メーカーからは--20℃です安定性が悪い為、一回のみ-80℃保存かフレッシュな状態でないと良い結果は出にくいとのことです。
ご利用いただけるのは嬉しいのですが、お試し特価でだされるサンプルとしては出てきたデータが悪い可能性が大きいのでそこで評価判断されてほしくないとのことです。それでもダメ元でも良ければということですが一度ご検討をどうぞよろしくお願いいたします。
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凍結させていない状態の良いサンプルがすぐに手に入れば、そちらを試したほうが良いと思いますが、どうでしょうか？
ほかに当てがなければオンデンザメをとりあえずやってみると良いかなとは思いますが、あまり推奨はされないようです。

@Yoshitake Kazutoshi
@平西滉太
了解です。オンデンザメ系はフレッシュサンプルは難しいですね、、、
他に適当なサンプル持っている人がいたらそちらにと思いますが、平西くん、どうですか？

鮎はどうなってんでしたっけ？

鮎はフレッシュサンプルはいつでもオッケーです

もし鮎でやるようであれば、stLFRも冷凍保存のサンプルでなく、そのフレッシュの物でDNA抽出した方が良いと思います。

stLFRもやってるんでしたっけ？くらべっこするのも手ですよね。比べるなら全く同じソースの方がいいかもしれませんが、かなり近いソースは入手できますよね。また鮎の方が実験としてはその後色々活用しやすいように思います。何てサービスでしたっけ？

Bionanoは単独では意味がなく、stLFR等で作ったコンティグが必要です。Bionanoを比較するとしたら、HiCか連鎖解析かなと思います。

鮎はこの間見た感じだと去年の冷凍サンプルから抽出したものでもそれなりに高分子のdnaが取れていました(精製に失敗していま再抽出していますが…)
明日か来週頭に新しくサンプリングする予定なのでそれでまた抽出し直しても良いかもしれません。凍結切片用の組織サンプルもどのみち取る予定です

恐らく平均1Mbp以上の長さのDNAを抽出する必要があり、stLFRなどよりも要求されるDNAの完全性は遥かに高いです。凍結する際の手順を問い合わせますのでお待ちください。

サンプリングしなおすとは、フレッシュなサンプルが明日手に入るという事でしょうか?　それなら急いで問い合わせます。

そうですね、明日の午前中に群馬水試の方から成熟確認の連絡を受けて、成熟個体が取れるようならサンプリングしに行く予定です。

今のところ、生きた鮎をその場で解剖して各組織をドライアイス+イソペンタンで急速凍結するつもりです。
お手数かけますが手順について問い合わせお願いします。

明日か来週の月曜日に生きた鮎をサンプリングにいきますが、群馬県水産試験場では純系に近い群馬系他、生きた鮎を常に維持していますので、明日に限らす、必要に応じてフレッシュサンプルの取得は可能と思います

早めに知っておくに越したことはないので、CCに當間くんを入れて冷蔵発送が良いのか問い合わせております。

メール届いています、ありがとうございます。とりあえず凍結しない冷蔵のサンプルも確保しておきます。

吉武さん　平均1mbは無理ですね。100kbの間違いではないですか？それでも平均は無理ですN50とまちがえてるのでは？

そうでなくていってるのなら、わかってないということでしょう

まず、そんな技術はヒトゲノム解析でyacを作ったグループだけでしょう。日本なら私だけだと思います。私が作ったのはBACですが。

少なくとも試験館内では出来ません。
ただ作ったなかで1mb以上の断片をpfgeでセレクションすることは可能です。その過程で多くはせん断されますが、切れたものは複製能を持たないので結果的にyeast内で複製できたものは1Mb以上あるということになり、そのせいでMega YACが構築できたとかんがえらます

詳しくはわかりませんが、bionanoで読めるリードの平均長は1Mbp弱らしいです。

そもそも1mv以上を分析できるCepfのpfgeのシステムを持ってるところはとても限られていると思います。うちにはありますけど、ゲノム解析専門のときろでもない限り、もってるとはおもわれません。

恐らくマイクロ流路系で小さなDNAを除去してから、そのまま続けてマイクロ流路でリードを読んでいる感じのムービーを見たことはあります。

それであれば、1mb以上の断片が含まれるDnaの取り方を行う必要がありますね。それであれば私は取れますが、普通のやり方はおろかSTLFR のやり方でもたぶん無理なので、どうとるのかきいてみるのがいいでしょう。

すくなくとも、そんなほとんど無理な条件のdnaの抽出方法が指示されて居ないのは明らかにおかしいので、出てきたデータの信頼性疑問があります。大丈夫なのでしょうか?キメラでないかとか、検証してるのでしょうか？あるいはたまたまキメラでないものだけ示してることはありませんか？
一度いくつかのやり方でとったのが

一度うちにパルスフィールドゲル電気泳動装置で自分達のとっているDNAのサイズが如何程なのか、知っておく方がいいでしょう。

BAC作製以後私の確立した技術が使われることはあるのかと思ってましたが、もしこの方法が1Mb以上のDNAを使うのが望ましいなら、ぜひ使いたいと思います。もともとナノポアで使いたいと思っていたので。

その場合凍結では到底無理で、生きてる細胞を得るところから始めたいと思います。精子はうってつけですが、魚なら血液で行けるかも知れません。ヒラメはダメでしたが。

すみません、返事が遅くなりました。抽出されたDNAではまず上手くいかないので、組織を送ってほしいと言われております。凍結させてはダメかなと思い冷蔵のほうが良いのか聞いてみましたが、下記のお返事が先ほどありました。

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サンプルは冷蔵ではなく、冷凍でお願いします。

液体窒素で凍らせた後に、チューブに入れて頂くと助かります。凍らせる前にチューブに入れた場合、チューブにサンプルが張り付き、取り出すことができなくなる可能性があります。

サンプルとしては筋肉組織ではなく、内臓、特に肝臓がベストです。

貴重なサンプルかと存じますが、可能であれば100mgを数本お送り下さい。解析に使用しなかったサンプルについてはご返却いたします。
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吉武さん
この見解はかなりリーズナブルです。
培養細胞ならDMSO入りなどでないと細胞が壊れますが、肝臓は比較的大丈夫というデータがあるのかと思います。凍結組織がその程度使えるのかについては私は知識を持ってませんが、肝臓ならここの細胞にばらけた状態のものがそこそこ得られるのでしょうか。
そして肝臓なら細胞をバラバラにすこことが可能なので、低分子はそこそこ含まれてると思いますが、多くの核内のDNAは未損傷のまま格納されている可能性はあります。BACでもソースとして検討する組織でした。
ということでフレッシュな組織をとって即凍らせて送るのでいいのではないでしょいうか。

肝臓のところ文がほぼダブってますね。そして肝臓なら＞そしてフレッシュな肝臓なら

ドライアイス+イソペンタンでの凍結でよければ、今日肝臓持って帰れます。万全を期すなら、来週、運搬用液体窒素タンクを持って行って肝臓取って来ましょうか

可能でしたら、指定された手順である液体窒素で凍結にのほうが良いのかなと思います。お手数をお掛け致しますが、何卒宜しくお願い致します。

浅川先生、コメントありがとうござます。私はどの組織がDNA抽出に向いているのか知りませんでしたが、肝臓は比較的DNA抽出に向いているのですね。この前イトヨのDNAをヒレと肝臓からそれぞれ抽出して頂いたときは、ヒレのほうが長いDNAが取れていたので、ちょっと意外でした。

サンプリングで妙な冒険はしない方が良いですね。サンプル送るタイミング(曜日など)いつでも良いなら、来週初めに行ってきます

送るのはいつでも大丈夫だと思います。発送先について問い合わせます。

液体窒素で凍結後はドライアイス中で保冷して冷蔵で送るということで大丈夫ですか？

群馬水試で液体窒素が手に入るようで、大学から持っていく必要なさそうです。群馬水試でサンプリング後、現地で発送してしまうのが良いように思います

魚種によってもちがうかもしれません。肝臓は細胞をばらしやすいてんで長いdnaをとるにはメリットがあります。細胞がバラバラでないと不溶な部分いdnaがもつれてまともにとれないからです

肝臓は大きくサンプリングしやすい組織なので、鮎の場合も問題なくサンプリングできます。

もちろん短いのは取れますよ。短いていっても数十kbのことですよ。コスミドサイズ40kbくらいとそれ以上ではライブラリー作製の難易度が全然違うので、扱ってる世界が違うと考えたらいいでしょう。

それならな鮎で試してみるのでいいと思います。

必要なら運搬用液体窒素タンクに入れて、川崎まで運びます

@平西滉太 @村茉南 @林健太朗

ジーンベイより連絡がありました。
現在stLFR解析のためのライブラリー調製を進めており、その過程でtagmentationを行いますが、フラグメントサイズ調整のために、GC含量に応じて酵素の使用量を調整することができます。
そこで、海洋生物6種（あるいは近縁種）のゲノムのおおよそのGC含量（<30%, 30-35%, 36-39%, 40-60%, >60%) をご存知でしたらご教示いただけないでしょうか。

前回、イルミナでシーケンスしアセンブルした結果を参照するか、平西君の場合はニシオンデンザメまたは他の近縁なサメ類のシーケンスデータを参照して、GC含量を教えてください。

P.mul: 40%
p.pel: 40%

なるはやで返信お願いします

ご連絡ありがとうございます。
E.tri 36-39%
H.fes 不明ですが同上でお願いします。

@Yonezawa Ryo
連絡ありがとうございます。
オンデンザメ48%です。よろしくお願いします。

@村茉南 ジーンベイから連絡があったのを転送し忘れてました。
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米澤　先生、吉武　先生

お世話になっております。

ライブラリー調製ですが、Elysia_trisnuataのみ2回トライし2回ともうまくいかず、引き続き試行錯誤中ですが、その他のサンプルにつきましてはライブラリーが作成できております。
本日、優先度の高い順に2サンプル（Somniosus_pacificus, Hypselodoris_festiva) のランを開始しており、金曜日には完了予定です。
その後、ベースコールを行い、データQCを経て、来週中か再来週前半には最初の2サンプルを納品させていただく予定です。

残りサンプルのランにつきましては、Elysia_trisnuataの状況にもよりますが、3サンプルを先にランさせていただくかもしれません。

どうぞよろしくお願い申し上げます。
＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／＿／
株式会社ジーンベイ（GeneBay, Inc.）
代表取締役社長
上村　泰央　／　UEMURA YASUO

先週のメールなので、最初の2サンプルは早ければ今週中に届くようです。
@平西滉太 @村茉南
https://github.com/BGI-Qingdao/stlfr2supernova_pipeline
を使ってアセンブルすることになるでしょうから、予習しておいてください。
分からないことがあれば早めに聞いて下さい。恐らくアセンブルするだけでも2週間、アノテーションをつけるのに1か月とか普通に計算時間だけでかかります。試行錯誤する時間が必要ならその分追加で時間がかかります。

ありがとうございます。勉強します。

先ほどジーンベイより下記の連絡がありました。明日には届くのではないかと思います。
もしUSB HDDが届いたら、311の私の席の隣の共通Windows PCに接続しておいてください。サーバのほうにデータを転送します。

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本日、先行の2サンプル（Somniosus_pacificus, Hypselodoris_festiva) につきまして、納品物一式を米澤先生宛に発送させていただきます。
ヤマトの追跡番号は、4413-9980-7936 となります。

納品書は後で私の方から中谷さんに渡しておきます

勿論大丈夫です。

では、明日やっておきます。

宜しくお願いします。

@Yonezawa Ryo ありがとうございます！

シーケンスファイルは、サーバでは「/suikou/files/m64k/backup/2020-09-21_stLFR/Sequence/」に入っています。
ログインしたフォルダの中に適当にフォルダを作って解析してください。おそらくメモリ512GB以上のサーバで実行したほうが無難です。（今m1536は私がテスト実行しているので、m768b, m768, m512b, m512i, m512pあたりが無難でしょう。)
ただ、26日には停電のためシャットダウンさせますが、それまでに解析が終わることはないと思うので、本番実行は停電明けになるでしょう。
一応28日の午前中には復旧予定です。

@平西滉太
自分で作った適当なフォルダの中で、
ln -s /suikou/files/m64k/backup/2020-09-21_stLFR/Sequence/Somniosus*.gz .
とすると、FASTQをそのフォルダに配置できます。

@村茉南
同様に
ln -s /suikou/files/m64k/backup/2020-09-21_stLFR/Sequence/Hypselodoris*.gz .
とすると、FASTQをそのフォルダに配置できます。

解析ツールは以前も紹介しましたが、
https://github.com/BGI-Qingdao/stlfr2supernova_pipeline
を使うのが良いと思います。
私自身、一度テスト実行しただけなので、上記サイトをよく読んで実行してください。アダプターのパラメータとかどうするのが良いのでしょうね。私もわかったら情報共有しますが、これから解析を行うこのグループチャットんお皆さんもぜひ時間のある時に練習もかねて実行してみてください。

ジーンベイからの納品資料を添付します。1サンプルあたり70GBaseは読めているようなので、単純なデプスだけなら十分量だと思われます。後は、どのくらいアセンブルで長く伸びるか、N50が100KBase超えれば良いですが。

村さんのstLFRのデータを試しにstlfr2supernovaでアセンブルしてみたら、3日くらいで終わってました。ただし、アセンブル結果は、
合計：1.046 Gbp
最大長：196,654 bp
N50：2,087 bp
コンティグ数(500bp以上)：661,398
となっていて、おそらく普通にIlluminaのショートリードを読んでCLCでアセンブルした結果とたいして違いはないように見えました。
パラメータの中でアダプター配列を指定するところを無視しているのが原因かもしれませんし、まだこれからパラメータやツールの検討が必要なのでしょう。
とりあえず何も考えずにアセンブルしてみるだけではstLFRの効果を引き出せてはいないようです。

アセンブル手順は、上の「profile」というファイルをサーバの適当なフォルダに作っておいて、profileファイルの上のほうにあるr1, r2を自分のファイルに変更して保存します。
その後、
/suikou/download/stlfr2supernova_pipeline_v2020-07-20/run.sh
というコマンドを実行して3日ほど待つと結果が出ていました。
使用したメモリは150GBほどだったので、メモリ200GB以上のサーバであれば大丈夫そうです。

ただ、上記の手順ではCLCでのアセンブルと大差ないので、もっと良いアセンブルが出来ないか検討する必要があります。。。

ちなみに、テストデータでダウンロード可能なstLFRのデータ（Human）を同じパラメータでアセンブルすると、
N50：278,220bp
となってました。

なので、そもそもデータが悪い可能性も十分にあります。

それから、stLFRのUMIバーコードについては、リード2の最後の42塩基の中に10bpのマーカーが3つ入っているようで、3つのUMIマーカーの間には6bpのスペーサーがあるようです。例えば、村さんのデータでバーコード「1000_1000_1103」と判定されたリードを抜き出して保存性を見てみたら…

こんな感じで、リバース側リードの最後のほうに10塩基保存性の高い箇所が3か所あるのがわかります。

普通はリードの先頭部分にUMIタグが来るはずなのですが、なんで最後の42塩基ぴったりにUMIタグが来れるのかなぁと不思議ではありますが、まぁそういう仕様だと言われているのでどうしようもないですが。

詳細は　把握してないけど、かなり微妙な結果だねえ。illuminaの単なるアセンブルと大差ないね。改善の余地はありますか？なにかを適当に処理すると劇的に改善されることを願います。

現状では大差ないので何とも言えませんが、まずは同一のUMIを持つリードがどのようにマッピングされるのか、マッピングされる範囲の大きさを調べてみたいと思っています。期待としては、同一コンティグ内の50kbp程度の範囲にばらけてマッピングされてほしいし、そうなっていればパラメータの検討で何とかなりそうだとは思います。

上村さんからのお返事で、SuperPlusというアセンブラーがあるようですね。流石よくご存じだなと思いました。
こちらのほうはMGI純正ツールで10x用のアセンブラーsupernovaの入力ファイルに変換するパイプライン、私がテストしていたのはBGIのパイプラインstlfr2supernovaでした。こっちのほうが今年も更新されていて新しいのですが、純正ツールも使ってみるべきですね。
アダプターとしては、下記が使われているとのことなので、stlfr2supernovaのprofileの中だと2セット目のアダプターを残せば良さそうではありました。
CTGTCTCTTATACACATCTTAGGAAGACAAGCACTGACGACATGA
TCTGCTGAGTCGAGAACGTCTCTGTGAGCCAAGGAGTTGCTCTGG

@村茉南
ジーンベイからの返答です。
また、Elysia_trisnuataのライブラリー調製ですが、DNAをほぼ使い切ってしまいましたので、よろしければ再度ご提供いただけないでしょうか？
その際に前回と同じ方法で調製されたDNAですと、同じようにうまくいかない恐れがあると考えております。
そこで可能であれば、SRE処理の前にエタ沈やAmPureなど精製のステップを挟んでいただいく、（前回は他のサンプルと比べて濃度が低かったので）今回は濃度が高くなるように調製いただく、といった対応をお願いできればと考えております。

忘れちゃったのだけど、上記の精製方法できるほどDNA残ってるんでしたっけ？

"stlfr assemble SuperPlus"ってググっても1件の論文しかヒットしないのだけど、こんな純正ツールよく知ってるなぁ…
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.16.992933v1.full.pdf

stLFRの論文の中で、10x Linked readsと比較している表がありました。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6499310/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=6499310_798tb02.jpg
Input genomic DNA (ng)が10 ngのサンプル(stLFR-3, stLFR-4)と10x Genomicsのサンプルでは、同一分子由来の平均リード数(Average cobarcoded reads per fragment)が8 : 50くらいと一桁違っていました。
これは、村さんのstLFRのデータを見た感じでは1割くらいの分子しか複数回読んだリードが取れておらず、大半の分子では1分子中読めたのが1リードのみだったのですが、10xだと5割くらいで複数回読んだリードが取れているということかなと思いました。

10xでは一分子当たり平均0.2xくらいで読めるようです。
https://academic.oup.com/gigascience/article/8/11/giz141/5643883
https://academic.oup.com/view-large/figure/186355588/giz141fig1.jpg
まだちゃんと比較していませんが、stLFRも同一分子で10リード以上読めたサンプルは同程度のカバレッジがありそうに思いました。

10 ngスタートがstLFRの推奨値なので、おそらく1 ngだと何か不都合が生じているのだと思いますが、10 ngスタートの場合、10x Linked readsと比較して複数回読めた分子(=10kbp以上などの合成ロングリードが取れる)の割合が少ないので、10x Linked readsだと50xくらいのカバレッジで十分なところが、300xくらい読まないとだめということなのかもしれません。1 ngスタートのほうが良いなら、林くんのサンプルはDNA量が10 ng以下なので結果的に良いスコアが出るのかもしれませんね。
あと、上村さんに紹介して頂いたSuperPlusではSupernovaによるコンティグ作成の後、scaffoldingして伸ばすようなので、合成ロングリードだけでコンティグを作れないような薄いカバレッジであるとするなら、SuperPlusのscaffoldingによって数倍長くなる可能性は十分にあると思います。
停電復旧次第試してみようと思っています。（途中まで試していたのですが、その時点でSuperPlusはメモリ400GBくらい使っていたので、150GBくらいで済んだstlfr2supernovaよりはメモリが必要になりそうです。)

おはようございます。stlfrのアセンブルをしようと思ったのですが、エラーが出てしまいました。何がおかしいのか自分一人だとわからないので見ていただけませんでしょうか。

上の写真がエラーの画面で、下が編集したprofileになります。

profileファイル中の下記の2行を変更してみてください。

SCRIPT_PATH="/suikou/download/stlfr2supernova_pipeline_v2020-07-20/"
SUPERNOVA="/suikou/tool/supernova-2.1.1/"

恐らくそれでうまくいくと思います。

@村茉南 なるはやで、サンプルの確認お願いします。

動きました！ありがとうございます！

良かったです。3日ほどでアセンブルが終わるかなと思うので、終わったら、出来あがったFASTAファイルの平均コンティグ長などを調べるために下記のコマンドを入力してみてください。
abyss-fac Human_output.fasta.gz

了解しました。終わり次第やって結果共有します。

saphyrを別にしようかと思いましたが、de novoアセンブル系なのでここに書いてしまいます。
先ほどアユのSaphyrの結果が届きました。
saphyrが何かは例えば下記ページ参照。
I have just received the result of saphyr.
For example, see the following page to know what saphyr is.

https://axel.as-1.co.jp/contents/bio/genomics/saphyr1

結果として、合計640Mbp, 216本のマップ（このマップの上にコンティグを張り付けていきます）、マップN50 16Mbpということで、期待通りかなり染色体に近いマップを作ることが出来ていると思われます。
あとは、stLFRなどでコンティグを作って、このマップに張り付ければほぼ染色体レベルのゲノムが出来てしまうでしょう。
The result is a total of 640 Mbp, 216 maps (we'll be sticking contigs on top of this map), and map N50 16 Mbp, which is pretty close to the chromosome as expected.
If we can make a contiguous map using stLFR or something similar and paste it on this map, we should be able to make an almost chromosome-level genome.

@Yoshitake Kazutoshi
ありがとうございます！DNAや組織サンプルの返送については何か連絡あったでしょうか？

確認いたしました、ありがとうございます。

SaphyrのリードN50は179 kbpだそうです。このくらい長く読めるとセントロメア以外はほぼ繋いでしまっている感じがします。

Saphyrのデータはサーバにログインしたら、
/suikou/files/m64k/backup/2020-09-29_SP200825-01/
に置いてあります。

stLFR用のアセンブラーのSuperPlusですが、マニュアル通りに入力しても、
ForceAssertEq(mReads[readId].size(),mQV.size()) at src/paths/long/BuildReadQGraph48.cc:1310 failed in function
というエラーが出て今のところアセンブルできていません。
MGIの鍵本さんに聞いてみようかなと思っています。

吉竹さん、あるいは把握している誰でも良いですが、ここ、あるいは他で出てきているゲノムアセンブル関係の新規技術のサマリーを作成してもらえますか？

名前だけのリストでしょうか?

saphyrはいわゆるフィンガープリントということと思いますが、それと塩基配列情報をどのように結びつけるのでしょうか？

塩基配列が分かれば、フィンガープリントを作成できるので、それを結びつけます。

まずはそれで結構です。誰かにスキーム図をつくってもらいラボのナレッジにするとともに、公開もしましょう。

出先なのですぐには探せませんが、Bionanoの論文を探せば、きっとそのような図があると思います。少なくともランチョンセミナーでは見た記憶があります。

そこがどこまでうまくいくのかなと思います。ロングcontig scaffold はうまくいくでしょうが、フィンガープリントの目印密度と分解能はどのくらいなのですか？

どのくらいのサイズのcontig scaffoldまで対応できますか？

6塩基を認識する酵素で標識を入れるそうなので、scaffold長が40kbpあれば10箇所くらい標識されそうなので、パターンを認識するには十分でしょうか。
stLFRは今のところN50が2kbp程度までしか伸びていないので、ナノポアで読んだほうが良いのかも知れません。

stLFRはMGI本社からの回答待です。

@Yonezawa Ryo
https://docs.google.com/spreadsheets/d/1rW7QIkSOcffnDncsR98n1GlOTLyqy3oS8ptJQHMZUzo/edit
ヒラミルミドリガイについて別個体のDNAを精製しました。すみません、お手数ですが発送のほどお願いします！

@Yoshitake Kazutoshi
アセンブルについてありがとうございます、、！まだ自分のサンプルについて手をつけられていないので明日挑戦してみます。

@Yoshitake Kazutoshi
アユのサンプル受け取りました、連絡ありがとうございます。
DNAの方確認したらそのままstLFRに出せるかと思いますが、どうしましょうか？

@村茉南 昨日は精製したやつ全量送ろうと言ったけど、念のため20ulは残して25ul送りましょう。分注は私がしておきます。

今日中に反対意見がないようでしたら、stLFRに出してしまいましょう。

船酔いで気分悪いです(T_T)

村さんのは今日出して来てしまいました。

アユだけ単独で送りますか？

あとナノポアで読む可能性も考えてDNAを残しておきましょう。

アユも早めにデータが欲しいので単独でも送ってしまいましょう。

分かりました。

@Toma Shogo 発送ついでにご飯食べに行ってしまったので、戻り次第ナノポアでどれくらいDNAが必要か連絡します。

@Yonezawa Ryo すみません今気づきました、、！ご対応ありがとうございます！！

@Yoshitake Kazutoshi お疲れ様です…
@Yonezawa Ryo 分かりました、濃度等を確認しておきます

ありがとうございます！

使用量は1ugですが、フローセルをwashして何度かシーケンスすると思うので5-10ug取っておくと良いです。

@Yoshitake Kazutoshi DNAサンプルがものすごい粘度なので、バッファー等の状態を知りたいです。
P200で少量を吸うと溶液全体がくっついてくる有様で、TEバッファーに落としても白っぽいものが溶けずに目視できました。DNAだけでこの粘度なのでしょうか？

坂くんが、ナノポアのチャンピオンデータを出そうと思ってた時に、ものすごい粘度だったので、DNAだけでその粘度だと思います

@Yonezawa Ryo 上村さんにDNA濃ゆいままでも大丈夫か聞いてもらえますか?

分かりました

@Toma Shogo @Yoshitake Kazutoshi
ジーンベイからの返答です。

ご質問の件ですが、高粘度は高分子に由来しているのでしょうか？それとも高濃度に由来しているのでしょうか？
あるいはDNA以外の（凝集しやすい）物質の混入に由来するのでしょうか？
抽出方法、濃度、吸光度等の情報をいただければ担当者に確認してみたいと思います。

ご確認お願いいたします。