トーク

とりあえず、ヒラムシやウミウシも含めた無脊椎動物のeDNAを増やす際に参考になりそうなページ

・生物技研の受託解析ページ
https://gikenbio.com/dnaanalysis/ngs/environment/metabarcoding/
配列は秘密らしいけど、プライマー名でググると出てきそうではある。どういう分類ならプライマーを作るのは可能なのか参考になりそう。

・大型無脊椎動物用？プライマー
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/edn3.177
EPTDr2nというプライマーを作った

https://www.mdpi.com/2073-4441/15/2/308
EPTDr2nを使ってみた

https://mbmg.pensoft.net/article/79351/
EPTDr2nともう一つ使ってみた


18S全体を増やすのが網羅性は高いけど、プランクトンが沢山増えてくるのが懸念。両端150bpだけで種判別できるならNGSで1サンプル1000万リードくらい読むので、プランクトンが100倍混ざってても全然平気かも。
ちゃんと考えて言っているわけではないけど、18S全長、 fwhF2/EPTDr2n、mlCOIintF/HCO2198の3セット位を試してみて、4月以降にHiSeqでまずは読んでみたい気がします。

EPTDはカゲロウ目(Ephemeroptera), カワゲラ目(Plecoptera), トビケラ目(Trichoptera), ハエ目(Diptera)の略で、実際に検証して見た結果、カゲロウ目の種やユスリカがかなり優先して検出されたとのことなので、もっと別のプライマーが良いかも。
https://edna-blog.com/laboratory/metaba-primer/

そういえば、核の18Sやミトコンドリアの16S全長そのままだと長すぎてIlluminaのフローセルの穴に入らないですね。rRNAを部分的に増幅可能なプライマーであれば、

18S：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3940700/
（SILVAのDBに入っている真核生物を使っている？一応SILVAの中にはヒラムシも入っているのだっけ？）

16S：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956713514001054
（軟体動物が入っているといってもイカ、タコだけ…）

の論文がすぐ見つかりました。18Sの論文のほうはターゲットをSILVAのDBから網羅的に見てくれているようなので、それを使えばよさそうですが、16Sは微妙かもしれません。網羅的に設計されているようではあるので、大丈夫かもしれませんけど。
16Sで検索すると当然ながらバクテリアの16Sが多くヒットしてしまい、真核ミトコンドリアの16Sでの例は埋もれてしまうので探しづらいですね。


甲殻類、軟体動物では16S, COIのプライマーではあまりうまくいかなかったという報告がありますが、
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0255110
この論文の16Sプライマーは古い教科書みたいでオンラインでは参照できず、COIは次の論文で1990年代で古いので、別の新しいプライマーセットなら増えるかも？
https://www.mbari.org/wp-content/uploads/2016/01/Folmer_94MMBB.pdf

ミトコンドリアの16Sを抜き出して自分で設計したほうが速いかな。

プライマーを設計してみました。
Forward: CGMCTGTTTAHCAAAAACAT
Reverse: CGCTGTTATCCCTRRGGTA
@井原一生 選んだプライマーと一緒に、上の配列もそのまま注文してみてください。

方法を忘れないうちにメモ：
Refseqに登録された真核生物のミトコンドリア全長12,207種のミトコンドリアを使い、cmsearhという相同性検索を行うプログラム(Mitosの中でrRNAのアノテーションに使われているプログラム)で16S rRNAを検索し、500塩基以上ヒットした領域を抜き出したところ、12,254コピーのrRNAがみつかりました（1種で複数コピー持っている種もいるので種数よりも多くなっている)。それをmafftでアライメントして、欠損が3割以下の保存性の比較的高いポジションについて、保存性をグラフにしてみました。16S rRNAの保存性の高い1000bp程度の中で、いくつか保存性の高い箇所があって、上で赤丸で示した場所にプライマーを設計してみました。

おおよそ300bp程度のPCR産物になるはずで、ヒラムシとウミウシではちゃんと増えそうでした。アコヤガイは微妙そうですが、まぁひとまずこれで。

プライマーの注文表を確認すると，下記のリバースプライマーが空のままですが大丈夫でした？
Reverse: CGCTGTTATCCCTRRGGTA

助かります。ありがとうございますm(_ _)m

そうですね、私のほうはTm値40℃、45サイクルで試してみてほしいです。
あと、ポジコンがまともそうに増えたのは3番目のものだけ？修正中のようなので、修正後に話せると良いですが。

大きさが違っていたのですね。ネガコンが出ているので何とも言えませんが、ネガコンは単純にPCRの時にDNAの代わりに水を入れたのか、DNA抽出時に水道水などをろ過したという意味なのでしょうか？

PCRだけでライブラリー調整したほうが楽ですかね。再度プライマーを注文する必要がありますが、スミスさんの作ったバーコードプライマーを木島さんの実験で使用して使えていたので、これだけの数となるとＰＣＲで済ませたほうが楽かも？

MiFishプライマーだと、1st PCR用は例えば下記のようになっています。
https://ednasociety.org/wp-content/uploads/2022/06/eDNA_manual_ver2_2.pdf

MiFish-E-F-v2 (5´–3´; 61 mer):（フォワード）
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNRGTTGGTAAATCTCGTGCCAGC
MiFish-E-R-v2 (5´–3´; 68 mer):（リバース）
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNGCATAGTGGGGTATCTAATCCTAG
TTTG

このNNNNNNから左側までを真似すればよいです。
なので、私の設計したプライマーだと
Forward: CGMCTGTTTAHCAAAAACAT
Reverse: CGCTGTTATCCCTRRGGTA
ですが、これにアダプター＋Nを足して、
Forward: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNCGMCTGTTTAHCAAAAACAT
Reverse: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCGCTGTTATCCCTRRGGTA
としたプライマーを注文すればよいです。

1st PCRがちゃんと増えたら、増えたPCR産物を1/100程度に希釈して（ある程度サンプル間の濃度を揃える）、スミスさんが注文してくれているインデックスプライマーで10サイクルくらいPCRを行えば良いようです。インデックスプライマーは下記のような配列です。

2nd PCR産物は、まとめて切り出し精製して、シーケンス用のライブラリーとしてしまえば良いかなと思います。

3月から湊さんが復帰するらしく、浅川先生から311を整理してもう一席作るようにとのことでした。明日相談させてください。

追加でありがとうございます。私のプライマーのほうは、ウミウシ、ヒラムシで見られている400bp程度のあたりのバンドが正解で、600bpくらいのは何だろうという感じです。ただ、これもシーケンスしてみればわかるので、私の設計したプライマーは今回の条件で次週ライブラリー調整をしましょう。

18Sのほうは、363塩基の12f-17r、312塩基の10f-14rについては前回の条件のほうが良いですね。これらは前回の条件でライブラリー調整に進みましょう。
18Sの568塩基の9f-10rはポジコンもそこまではっきり増えていないし、正直微妙ですね。他のプライマーがちゃんと増えているから、これは使わなくて良いかなと思います。

あとは、上で説明したアダプターをつけたプライマーを設計して、確認のため見せてください。
来週はそのプライマーでPCRをします。

プライマーの配列はOKです。⑨forwardと⑩ reverseはあまり期待した増幅が起きていなかったので、もう頼まないで良いかなと思いました。

PCR産物の塩基数としては、アダプター＋N分増えるというので合っています。

9f, 10rを除いたプライマーを発注しておいてもらえたらと思います。

私は今週は今日までですが、来週は火曜日以外は大学に来ているかなと思います。

今日はDB開発のため図書館にいるのですが、17:00以降はラボに戻ります。可能であればそれからPCRの相談をできればと思います。

結果、拝見しました。
16Sのほうの私の設計したプライマーについては、45サイクル回すのでこんなものかなと思います。
10f-14rについては、1回目はちゃんと増えていたので、もう一度PCRしたほうがよさそうです。
12f-17rでネガコンがうっすら出ているのは、まぁ仕方ないのでしょうかね。どれもネガコンが一番薄いのでよさそうではあります。

・もう一度だけ、10f-14rのPCRを行ってみる
・濃度をそろえるといいましたが、大体揃っているようなので、とりあえず1/100に希釈して、それをテンプレートに上のLiuくんのPCRサイクルの条件からTm値だけ参考にして（64度）、それ以外はこれまでのPCRと同じ温度設定で10サイクルのPCRをかければよさそうです。PCRの量はこれまで通り10ulで良いです。2nd PCR産物を電気泳動したゲルから切り出し精製をします。

了解です。

https://1drv.ms/w/s!ApyvSGepW4Lkg9VMjbJpnVy29YK0-g?e=8iInU6

なるほど。確かヒラムシのサンプルを読んだのでヒラムシだけで良いような気がしましたけど、どうでしたっけ?
目的のサイズ以外は菌類なのですね。菌類のどういう遺伝子にヒットしていました?

なるほど（よくわからん!）、ということで、次にお会いしたときに結果を見せてください。明日来るのでしたっけ？

それではお昼すぎに会いましょう!

おはようございます。
フローセルは取り外して大丈夫です。

リモートから見てみると結果は
E:\data\ihara
の中だと思います。